Nima uchun konfokal mikroskop kerak?
1. Bizning buyuk salaflarimizning sa'y-harakatlari va takomillashuvlaridan so'ng, optik mikroskop mukammallik darajasiga yetdi. Darhaqiqat, oddiy mikroskoplar bizga go'zal mikroskopik tasvirlarni sodda va tez taqdim etishi mumkin. Biroq, bu deyarli mukammal mikroskop dunyosiga inqilobiy yangilik olib kelgan voqea sodir bo'ldi, bu "lazerli skanerlash konfokal mikroskop" ixtirosi. Ushbu yangi turdagi mikroskopning xususiyati shundaki, u optik tizimni qabul qiladi, u faqat fokus to'plangan sirtdagi tasvir ma'lumotlarini chiqaradi va fokusni o'zgartirganda olingan ma'lumotni tasvir xotirasida tiklaydi, shunda to'liq 3D ma'lumot olish mumkin bo'ladi. olingan. Aql-idrokning yorqin tasviri. Ushbu usul yordamida oddiy mikroskop bilan tasdiqlab bo'lmaydigan sirt shakli haqidagi ma'lumotlarni osongina olish mumkin. Bundan tashqari, oddiy optik mikroskoplar uchun "ravshanlikni oshirish" va "fokus chuqurligini chuqurlashtirish" qarama-qarshi shartlardir, ayniqsa yuqori kattalashtirishda bu qarama-qarshilik ko'proq namoyon bo'ladi, ammo konfokal mikroskoplar nuqtai nazaridan bu muammo osonlikcha hal qilinadi.
2. Konfokal optik tizimning afzalliklari
Konfokal optik tizim namunada nuqtali yoritishni amalga oshiradi va aks ettirilgan yorug'lik nuqta retseptorlari tomonidan ham qabul qilinadi. Namuna fokus holatiga qo'yilganda deyarli barcha aks ettirilgan yorug'lik fotoretseptorga etib borishi mumkin va namuna fokusdan tashqarida bo'lsa, aks ettirilgan yorug'lik fotoreseptorga etib bormaydi. Ya'ni, konfokal optik tizimda faqat fokus nuqtasiga to'g'ri keladigan tasvir chiqariladi va yorug'lik nuqtalari va keraksiz tarqoq yorug'lik himoyalanadi.
3. Nima uchun lazerdan foydalanish kerak?
Konfokal optik tizimda namuna bir nuqtada yoritiladi va aks ettirilgan yorug'lik ham nuqta fotoreseptorlari tomonidan qabul qilinadi. Shuning uchun nuqtali yorug'lik manbai zarur bo'ladi. Lazerlar juda nuqtali yorug'lik manbalaridir. Ko'pgina hollarda lazer yorug'lik manbalari konfokal mikroskoplar uchun yorug'lik manbalari sifatida ishlatiladi. Bundan tashqari, lazerning monoxromatikligi, yo'nalishi va mukammal nur shaklining xususiyatlari ham uni keng qo'llashning muhim sabablari hisoblanadi.
4. Yuqori tezlikda skanerlash asosida real vaqt rejimida kuzatish mumkin bo'ladi
Lazerli skanerlash uchun gorizontal yo'nalish akustik optik deflektorni (AO elementi) qabul qiladi va vertikal yo'nalish servo elektron boshqariladigan nurli skanerlash oynasini (Servo Galvano-oyna) qabul qiladi. Akusto-optik burilish moslamasi mexanik tebranish qismiga ega emasligi sababli, u yuqori tezlikda skanerlashni amalga oshirishi mumkin va monitor ekranida real vaqt rejimida kuzatish mumkin. Ushbu yuqori tezlikda tasvirlash diqqatni jamlash va pozitsiyani olish tezligiga bevosita ta'sir qiluvchi juda muhim elementdir.
5. Fokus holati va yorqinlik o'rtasidagi bog'liqlik
Konfokal optik tizimda namuna fokus holatiga to'g'ri joylashtirilganida namunaning yorqinligi maksimal bo'ladi va uning yorqinligi undan oldin va keyin keskin kamayadi (4-rasmdagi qattiq chiziq). Fokus tekisligining sezgir selektivligi, shuningdek, konfokal mikroskop balandligi yo'nalishini aniqlash va fokus chuqurligini kengaytirish tamoyilidir. Bundan farqli o'laroq, oddiy optik mikroskoplar fokus holatidan oldin va keyin aniq yorqinlik o'zgarishlariga ega emas.
6. Yuqori kontrast, yuqori aniqlik
Oddiy optik mikroskoplarda aks ettirilgan yorug'likning fokus qismidan interferensiyasi tufayli u fokusli tasvirlash qismi bilan ustma-ust tushadi, natijada tasvir kontrasti pasayadi. Boshqa tomondan, konfokal optik tizimda markazdan tashqarida tarqalgan yorug'lik va ob'ektiv linzalari ichidagi tarqalgan yorug'lik deyarli butunlay yo'q qilinadi, shuning uchun juda yuqori kontrastli tasvirni olish mumkin. Bundan tashqari, yorug'lik ob'ektiv linzalari orqali ikki marta o'tganligi sababli, nuqta tasviri birinchi navbatda aniqlanadi, bu ham mikroskopning aniqlash qobiliyatini yaxshilaydi.
7. Optik lokalizatsiya funksiyasi
Konfokal optik tizimda fokus nuqtasi bilan mos keladigan nuqtadan tashqari aks ettirilgan yorug'lik mikropora bilan himoyalangan. Shuning uchun, uch o'lchamli namunani kuzatishda, xuddi namuna fokus tekisligi bilan kesilgandek tasvir hosil bo'ladi. Ushbu effekt optik lokalizatsiya sifatida tanilgan va konfokal optik tizimlarning mutaxassisliklaridan biridir.
8. Focus mobil xotira funksiyasi
Fokus nuqtasidan tashqarida aks ettirilgan yorug'lik deb ataladigan narsa mikroporlar bilan himoyalangan. Boshqa tomondan, konfokal optik tizim tomonidan yaratilgan tasvirning barcha nuqtalari fokus nuqtasi bilan mos keladi deb hisoblash mumkin. Shuning uchun, agar uch o'lchamli namuna Z o'qi (optik o'q) bo'ylab harakatlantirilsa, tasvirlar to'planadi va xotirada saqlanadi va nihoyat, butun namuna va fokus nuqtasi tomonidan hosil qilingan tasvir olinadi. Fokus chuqurligini shu tarzda cheksiz chuqurlashtirish funksiyasi mobil xotira funksiyasi deb ataladi.
9. Sirt shaklini o'lchash funktsiyasi
Fokusni o'zgartirish funktsiyasi nuqtai nazaridan, namunaning sirt shakli sirt balandligini qayd qilish sxemasini qo'shish orqali kontaktsiz o'lchanishi mumkin. Ushbu funktsiyaga asoslanib, har bir pikseldagi maksimal yorug'lik qiymatidan hosil bo'lgan Z o'qi koordinatalarini yozib olish mumkin va bu ma'lumotlarga asoslanib, namuna sirtining shakli bilan bog'liq ma'lumotlarni olish mumkin.
10. Yuqori aniqlikdagi mikro o'lchamli o'lchov funktsiyasi
Yorug'likni qabul qilish moslamasi 1-o'lchamli CCD tasvir sensorini qabul qiladi, shuning uchun skanerlash moslamasining skanerlash egilishi unga ta'sir qilmaydi, shuning uchun yuqori aniqlikdagi o'lchashni yakunlash mumkin. Bunga qo'shimcha ravishda, sozlanishi fokus chuqurligi (chuqurlashtirish) bilan diqqatni o'zgartirish xotira funksiyasidan foydalanish tufayli fokusning siljishi natijasida yuzaga kelgan o'lchash xatosi yo'q qilinishi mumkin.
11. Uch o'lchovli tasvirni tahlil qilish
Sirt shaklini o'lchash funktsiyasidan foydalanib, siz namuna yuzasining uch o'lchovli tasvirini osongina yaratishingiz mumkin. Nafaqat bu, balki turli xil tahlillarni ham amalga oshirishi mumkin: sirt pürüzlülüğünü o'lchash, maydon, hajm, sirt maydoni, aylana, radius, maksimal uzunlik, perimetr, og'irlik markazi, tomografik tasvir, FFT transformatsiyasi, chiziq kengligi o'lchovi va boshqalar. .
Lazerli konfokal skanerlash mikroskopidan nafaqat hujayra morfologiyasini kuzatish, balki hujayra ichidagi biokimyoviy komponentlarning miqdoriy tahlili, optik zichlik statistikasi va hujayra morfologiyasini o'lchash uchun ham foydalanish mumkin.
