Optik mikroskopning asosiy kuzatish usuli floresan kuzatuvidir
Floresansiya deganda lyuminestsent moddaning ma'lum bir to'lqin uzunligi nuri bilan nurlantirilganda deyarli bir vaqtning o'zida kattaroq to'lqin uzunligiga ega yorug'lik chiqarish jarayoni tushuniladi (1-rasm). Muayyan to'lqin uzunligidagi yorug'lik (qo'zg'alish to'lqin uzunligi) molekulaga, masalan, florofordagi yorug'likka tushganda, foton energiyasi molekula elektronlari tomonidan so'riladi. Keyinchalik, elektronlar asosiy holatdan (S0) yuqori energiya darajasiga, hayajonlangan holatga (S1') o'tadi. Bu jarayon qo'zg'alish① deb ataladi. Elektron hayajonlangan holatda 10-9–10-8 soniya davomida qoladi, bu vaqt davomida elektron bir oz energiyani yo'qotadi②. Elektronlarning qo'zg'alilgan holatdan (S1) chiqib, asosiy holatga qaytishi jarayonida③ qo'zg'alish jarayonida so'rilgan qolgan energiya ajralib chiqadi.
Floresan molekulasining qo'zg'alish holatida yashash vaqti odatda nanosekund darajasida bo'lgan floresan umri bo'lib, flüoresan molekulasining o'ziga xos xususiyati hisoblanadi. Flüoresans umr bo'yi tasvirlash texnologiyasidan foydalanadigan floresan umr bo'yi tasvirlash (FLIM) floresan umr bo'yi tasvirlash (FLIM) deb ataladi. Floresans intensivligini tasvirlashdan tashqari, molekulyar konformatsiyani, molekulalararo o'zaro ta'sirlarni va molekulalarning mikro muhitini olish uchun yanada chuqurroq funktsional va aniq o'lchovlarni olish mumkin. An'anaviy optik tasvir yordamida olish qiyin bo'lgan ma'lumot.
Floresansiyaning yana bir muhim xususiyati - Stokes siljishi, qo'zg'alish va emissiya cho'qqilari orasidagi to'lqin uzunligidagi farq (2-rasm). Odatda emissiya to'lqin uzunligi qo'zg'alish to'lqin uzunligidan uzunroqdir. Buning sababi shundaki, floresan modda qo'zg'atilgandan keyin va fotonlarni chiqarishdan oldin elektronlar gevşeme jarayonida energiyaning bir qismini yo'qotadi. Kattaroq Stokes siljishiga ega lyuminestsent moddalarni floresan mikroskop ostida kuzatish osonroq.
Floresan mikroskopiya va lyuminestsent filtr kublari
Floresan mikroskop - kuzatish va tasvirlash uchun floresans xususiyatlaridan foydalanadigan optik mikroskop va hujayra biologiyasi, neyrobiologiya, botanika, mikrobiologiya, patologiya va genetika kabi turli sohalarda keng qo'llaniladi. Floresan tasvirlash yuqori sezuvchanlik va yuqori o'ziga xoslik afzalliklariga ega va to'qimalar va hujayralardagi o'ziga xos oqsillar va organellalarning tarqalishini kuzatish, kolokalizatsiya va o'zaro ta'sirni o'rganish, ion kontsentratsiyasining o'zgarishi kabi hayotiy dinamik jarayonlarni kuzatish uchun juda mos keladi. , va boshqalar.
Hujayralardagi ko'pchilik molekulalar lyuminestsatsiyaga uchramaydi va ularni ko'rish uchun ular lyuminestsent bilan belgilanishi kerak. To'g'ridan-to'g'ri yorliqlash (masalan, DNKni belgilash uchun DAPI dan foydalanish) yoki antikorlarning antigen bog'lash xususiyatlaridan foydalangan holda immuno-bo'yash yoki maqsadli oqsillarni belgilash uchun floresan oqsillarni (GFP, yashil floresan oqsil kabi) ishlatish kabi lyuminestsent yorliqlashning ko'plab usullari mavjud. , va teskari bog'lanish. Sintetik bo'yoqlar (masalan, Fura-2) va boshqalar.
Hozirgi vaqtda floresan mikroskop turli laboratoriyalar va tasvir platformalarining standart tasvirlash uskunasiga aylandi va kundalik tajribalarimiz uchun yaxshi yordamchidir. Floresan mikroskoplar asosan uch toifaga bo'linadi: tik floresan mikroskoplar (tilim uchun mos), teskari lyuminestsent mikroskoplar (tilimlarni hisobga olgan holda tirik hujayralar uchun mos), lyuminestsent stereoskoplar (kattaroq namunalar uchun mos, masalan, o'simliklar, ult/zebrafish (ad) ), medaka, sichqoncha / kalamush organlari va boshqalar).
Floresan filtr bloki mikroskop floresan tasvirining asosiy komponentidir. U uch qismdan iborat: qo'zg'atuvchi filtr, emissiya filtri va dikroik nurni ajratuvchi. U filtr g'ildiragiga o'rnatiladi. Masalan, Leica DMi8 6-pozitsiyali filtr g'ildiragi bilan jihozlangan (3-rasm). Turli mikroskop g'ildiraklarining joylashuvi soni har xil bo'ladi va ba'zi mikroskoplar filtr blokli slaydlardan foydalanadi.
Filtr bloki floresan tasvirlashda muhim rol o'ynaydi: qo'zg'atuvchi filtr namunani qo'zg'atish uchun qo'zg'atuvchi nurni tanlaydi va boshqa to'lqin uzunliklarining yorug'ligini bloklaydi; qo'zg'atuvchi filtrdan o'tadigan yorug'lik dikroik oynadan o'tadi (uning vazifasi qo'zg'atuvchi nurni aks ettirish va floresansni o'tkazishdir), Ko'zgudan so'ng u ob'ektiv linzalar tomonidan fokuslanadi, namunani nurlantiradi va mos keladigan floresansni qo'zg'atadi, ya'ni , yorug'lik chiqaradi. Chiqarilgan yorug'lik ob'ektiv ob'ektiv tomonidan to'planadi, dikroik nurni ajratuvchidan o'tadi va emissiya filtriga etib boradi. 4-rasmda ko'rsatilganidek: qo'zg'alish to'lqin uzunligi 450-490nm, dikroik oyna 510nm dan qisqaroq yorug'likni aks ettiradi, 510nm dan uzoqroq yorug'likni uzatadi va chiqarilgan yorug'likning qabul qilish diapazoni 520-560nm.
