Optik mikroskopning asosiy kuzatish usuli floresan kuzatuvidir
Floresan fenomeni
Floresansiya deganda lyuminestsent moddaning ma'lum bir to'lqin uzunligidagi yorug'lik bilan nurlantirilganda deyarli bir vaqtning o'zida kattaroq to'lqin uzunligiga ega yorug'lik chiqarish jarayoni tushuniladi (1-rasm). Muayyan toʻlqin uzunligidagi yorugʻlik (qoʻzgʻalish toʻlqin uzunligi) molekulaga (masalan, florofordagi molekula) tushganda, foton energiyasi molekula elektronlari tomonidan soʻriladi. Keyinchalik, elektronlar asosiy holatdan (S0) yuqori energiya darajasiga, hayajonlangan holatga (S1') o'tadi. Bu jarayon qo'zg'alish① deb ataladi. Elektron hayajonlangan holatda 10-9–10-8 soniya davomida qoladi, bu vaqtda elektron bir oz energiyani ② yo'qotadi. Qo'zg'algan holatdan chiqish (S1) va asosiy holatga qaytish jarayonida ③ qo'zg'alish jarayonida so'rilgan qolgan energiya chiqariladi.
Floresan molekulasining qo'zg'aluvchan holatda bo'lish vaqti floresan molekulasining o'ziga xos xususiyati bo'lgan, odatda nanosekundlarda bo'lgan floresan umridir. Floresansning ishlash muddatidan foydalangan holda tasvirlash texnologiyasi Fluoresans umrbod tasvirlash (FLIM) deb nomlanadi, u molekulyar konformatsiyani, molekulalararo o'zaro ta'sirlarni va molekulyar mikro muhitlarni olish uchun floresans intensivligini tasvirlashdan tashqari yanada chuqurroq funktsional va aniq o'lchovlarni amalga oshirishi mumkin. an'anaviy optik tasvir yordamida olish qiyin bo'lgan ma'lumotlar.
Floresansiyaning yana bir muhim xususiyati - Stokes siljishi, qo'zg'alish va emissiya cho'qqilari orasidagi to'lqin uzunligidagi farq (2-rasm). Odatda emissiya yorug'lik to'lqin uzunligi qo'zg'atuvchi yorug'lik to'lqin uzunligidan uzunroqdir. Buning sababi shundaki, lyuminestsent modda qo'zg'atilgandan keyin va foton chiqarilishidan oldin elektronlar bo'shashish jarayoni orqali energiyaning bir qismini yo'qotadi. Kattaroq Stokes siljishiga ega lyuminestsent moddalarni floresan mikroskop ostida kuzatish osonroq.
Floresan mikroskoplari va lyuminestsent filtr bloklari
Floresan mikroskopi - kuzatish va tasvirlash uchun floresans xususiyatlaridan foydalanadigan optik mikroskop va hujayra biologiyasi, neyrobiologiya, botanika, mikrobiologiya, patologiya, genetika va boshqa sohalarda keng qo'llaniladi. Floresan tasvirlash yuqori sezuvchanlik va yuqori o'ziga xoslik afzalliklariga ega va to'qimalar va hujayralardagi o'ziga xos oqsillar, organellalar va boshqalarning tarqalishini kuzatish, birgalikda lokalizatsiya va o'zaro ta'sirni o'rganish, hayot dinamikasini kuzatish uchun juda mos keladi. ion konsentratsiyasining o'zgarishi kabi jarayonlar.
Hujayralardagi ko'pchilik molekulalar floresan nurlanmaydi va ularni ko'rish uchun ular lyuminestsent belgilar bilan belgilanishi kerak. To'g'ridan-to'g'ri etiketlanishi mumkin bo'lgan lyuminestsent yorliqlashning ko'plab usullari mavjud (masalan, DNKni belgilash uchun DAPI dan foydalanish) yoki antikorlarning antigenni bog'lash xususiyatlaridan foydalangan holda immuno-bo'yash yoki maqsadli oqsilni floresan oqsillar (GFP, yashil kabi) bilan belgilash mumkin. lyuminestsent oqsil) yoki teskari bog'lanish. sintetik bo'yoqlar (masalan, Fura-2) va boshqalar.
Hozirgi vaqtda floresan mikroskop turli laboratoriyalar va tasvir platformalarining standart tasvirlash uskunasiga aylandi va u bizning kundalik tajribalarimiz uchun yaxshi yordamchidir. Floresan mikroskoplar asosan uchta toifaga bo'linadi: tik turgan floresan mikroskoplar (kesmalar uchun mos), teskari floresan mikroskoplar (kesimlarni hisobga olgan holda tirik hujayralar uchun mos), lyuminestsent stereoskopik mikroskoplar (kattaroq namunalar uchun mos, masalan, o'simliklar, zebra baliqlari (adultult / zebrafish)). embrion) , medaka, sichqon / kalamush organlari va boshqalar).
Floresan filtr bloki mikroskoplarda floresan tasvirlashning asosiy komponentidir. U qo'zg'atuvchi filtr, emissiya filtri va dikroik nurni ajratgichdan iborat. U filtr g'ildiragiga o'rnatiladi, masalan, Leica DMi8 6-pozitsiyali filtr g'ildiragi bilan jihozlangan (3-rasm). ). Turli mikroskoplar turli xil g'ildirak pozitsiyalariga ega va ba'zi mikroskoplar filtr slaydlaridan foydalanadi.
Filtr bloki floresan tasvirlashda muhim rol o'ynaydi: qo'zg'atuvchi filtr namunani qo'zg'atish uchun qo'zg'atuvchi nurni tanlaydi va yorug'likning boshqa to'lqin uzunliklarini bloklaydi; qo'zg'atuvchi filtrdan o'tadigan yorug'lik dixroik nur ajratgichdan o'tadi (uning roli qo'zg'atuvchi nurni aks ettirish va floresansni o'tkazishdir), aks ettirilgandan so'ng, u ob'ektiv linzalar tomonidan fokuslanadi, namunaga nurlanadi va mos keladigan floresans hayajonlanadi. yorug'lik chiqaradi. Chiqarilgan yorug'lik ob'ektiv ob'ektiv tomonidan to'planadi, dikroik nurni ajratuvchidan o'tadi va emissiya filtriga etib boradi. 4-rasmda ko'rsatilganidek: qo'zg'alish to'lqin uzunligi 450-490nm, dixroik nurni ajratuvchi 510nm dan qisqaroq yorug'likni aks ettiradi, 510nm dan uzoqroq nurni uzatadi va emissiya nurini qabul qilish diapazoni 520-560nm.
Floresan mikroskoplarida keng qo'llaniladigan floresan filtrlarni ikki turga bo'lish mumkin: uzoq o'tish (qisqacha LP) va tarmoqli o'tish (qisqacha BP). Tarmoqli o'tkazuvchanlik odatda markaziy to'lqin uzunligi va intervalning kengligi bilan belgilanadi, masalan, 480/40, ya'ni 460-500nm dan yorug'lik o'tishi mumkin. 515 LP kabi uzoq o'tkazuvchan filtrlar to'lqin uzunligi 515 nm dan ortiq bo'lgan yorug'likdan o'tadi (5-rasm).
Floresan moddalarning o'ziga xos qo'zg'alish (yutilish) egri chizig'i va emissiya egri chizig'i bor, qo'zg'alish cho'qqisi ideal qo'zg'alish to'lqin uzunligi (yuqori qo'zg'alish samaradorligi, qo'zg'alish yorug'lik energiyasini kamaytiradi, hujayralar va bo'yoqlarni himoya qiladi), emissiya egri chizig'i esa emissiya floresan to'lqin uzunligidir. diapazon. Shuning uchun, tajribada biz qo'zg'alish uchun iloji boricha qo'zg'alish cho'qqisiga yaqin to'lqin uzunligini tanlaymiz va qabul qilish diapazoni emissiya cho'qqisini o'z ichiga olishi kerak. Masalan, Alexa Fluor 488 ning qo'zg'alish cho'qqisi 500 nm ni tashkil qiladi va 480/40 qo'zg'alish filtri floresan mikroskopda tanlanishi mumkin.
Filtr kublarining tafsilotlarini mikroskopni tasvirlash dasturida ko'rish mumkin. Bo'yoqlarni tushunish va namunangizga eng mos keladigan filtrni topish floresan ko'rish uchun juda muhimdir. Floresan bo'yoqlari va lyuminestsent oqsillarning spektral ma'lumotlari odatda ko'rsatmalarda ko'rsatilgan va ularni Internetda ham topish mumkin.
Floresan zondlarining qo'zg'alish va emissiya to'lqin uzunliklariga qo'shimcha ravishda, filtr bloklarini tanlashda o'ziga xos bo'lmagan qo'zg'alish bor-yo'qligini va ko'p rangli etiketli namunalar uchun o'zaro faoliyat rang mavjudligini ham hisobga olish kerak. Bundan tashqari, ishlatiladigan floresan yorug'lik manbasini hisobga olish kerak. Hozirgi vaqtda tez-tez ishlatiladigan lyuminestsent yorug'lik manbalari simob lampalar, metall halid lampalar va so'nggi yillarda tez rivojlangan LED yorug'lik manbalarini o'z ichiga oladi. Floresan yorug'lik manbasining spektri uzluksiz yoki uzluksiz bo'lib, turli to'lqin uzunliklari diapazonlarida energiya har xil bo'ladi. LED yorug'lik manbai nisbatan tor spektrli diapazon, barqaror energiya chiqishi, uzoq umr, xavfsizroq va atrof-muhit muhofazasi va boshqa ko'plab afzalliklarga ega bo'lganligi sababli asta-sekin flüoresan mikroskopning asosiy yorug'lik manbaiga aylanib bormoqda.
Mikroskopning o'rnatilgan filtr blokidan tashqari, tashqi tez g'ildirak ham mavjud (7-rasm). Leica tashqi tez g'ildiragiga ulashgan filtrning konversiya tezligi 27 ms ni tashkil qiladi, bu FRET va Fura2 nisbati kaltsiy tasviri kabi yuqori tezlikda ko'p rangli tajribalarni amalga oshirishi mumkin. (8-rasm) va boshqalar.
Floresan mikroskopining ko'rish usullarining keng doirasi
Turli xil floresan ko'rish ehtiyojlarini qondirish uchun floresan mikroskoplarga qo'shimcha ravishda turli xil floresan mikroskopiya ko'rish echimlari ishlab chiqilgan:
Leica THUNDER Imager kabi keng maydonli yuqori aniqlikdagi tasvirlash tizimlari Leica kompaniyasining innovatsion Clearing texnologiyasidan foydalanib, tasvirlash jarayonida fokal bo‘lmagan tekislik shovqin signallarini samarali tarzda olib tashlaydi, aniq tasvirlar va yuqori tezlikda tasvirlashning afzalliklarini taqdim etadi;
Konfokal lazerli skanerlash mikroskopi fokal bo'lmagan tekislik shovqinlarini bartaraf etish uchun teshiklardan foydalanadi, optik kesmani amalga oshiradi va yuqori aniqlikdagi tasvirlar va uch o'lchovli tasvirlarni oladi;
Diffraktsiya chegarasidan o'tuvchi ultra yuqori aniqlikdagi mikroskoplar va nano-mikroskoplar 200 nm dan kichikroq nozik tuzilmalarni kuzatishi mumkin;
Qalin to'qimalarni va chuqur in vivo tasvirni ko'rish uchun multifoton qo'zg'alish printsipidan foydalanadigan multifotonli tasvirlash tizimi;
Yuqori vaqtinchalik va fazoviy piksellar sonini, tez tasvirlash tezligini, yuqori piksellar sonini, past fototoksiklikka ega yorug'lik varaqlarini tasvirlash texnologiyasi, ayniqsa rivojlanish va in vivo dinamik kuzatish bo'yicha tadqiqotlar uchun mos;
Floresan moddasi kontsentratsiyasi, fotooqartirish, qo'zg'atuvchi yorug'lik intensivligi va boshqalar kabi omillarga ta'sir qilmaydigan floresan umr bo'yi tasvirlash (FLIM) yanada chuqurroq funktsional va aniq o'lchovlarni amalga oshirishi mumkin;
Floresan korrelyatsiya spektroskopiyasi (FCS) va floresan o'zaro bog'liqlik spektroskopiyasi (FCCS), floresan molekulalarning molekulyar soni va diffuziya koeffitsientini o'lchaydi, shu bilan molekulyar kontsentratsiyani, molekulyar o'lchamni, yopishqoqlikni, molekulyar harakatni, molekulyar bog'lanishni, molekulyar optsion/dizolni tahlil qiladi;
Juda yuqori z o'qi o'lchamlari bilan umumiy ichki aks ettiruvchi floresan mikroskopiya (TIRF) hujayra membranasi sirtlarining molekulyar tuzilishi va dinamikasini o'rganish uchun idealdir.
