Ikki fotonli floresan mikroskopning texnik tavsiflari va foydalanish ko'nikmalari
Ikki fotonli flüoresan mikroskopiya lazerli skanerlash konfokal mikroskopiya va ikki fotonli qo'zg'alish texnologiyasini birlashtirgan yangi texnologiyadir.
Ikki fotonli qo'zg'alishning asosiy printsipi: yuqori foton zichligi bo'lsa, lyuminestsent molekulalar bir vaqtning o'zida ikkita uzun to'lqinli fotonni o'zlashtira oladi va qo'zg'aluvchan holat deb ataladigan qisqa vaqtdan keyin qisqaroq to'lqinli fotonni chiqaradi. . ; Ta'sir floresan molekulani qo'zg'atish uchun to'lqin uzunligi yarmi uzun to'lqin uzunligi bo'lgan fotonni ishlatish bilan bir xil. Ikki fotonli qo'zg'alish yuqori foton zichligini talab qiladi. Hujayralarga zarar bermaslik uchun ikki fotonli mikroskop yuqori energiyali rejimda qulflangan impulsli lazerlardan foydalanadi. Ushbu lazer chiqaradigan lazer yuqori cho'qqi energiyasiga va past o'rtacha energiyaga ega, uning puls kengligi atigi 100 femtosekundni tashkil qiladi va uning davri 80 dan 100 megahertsgacha yetishi mumkin. Impulsli lazerning fotonlarini fokuslash uchun yuqori raqamli diafragma ob'ektiv linzalaridan foydalanganda, ob'ektiv linzaning markazlashtirilgan nuqtasida foton zichligi eng yuqori bo'ladi va ikki fotonli qo'zg'alish faqat ob'ektiv linzaning markazlashtirilgan nuqtasida sodir bo'ladi, shuning uchun ikki fotonli mikroskopga konfokal pin teshigi kerak emas, bu Flüoresansni aniqlash samaradorligini oshiradi. Bu morfologiya, molekulyar hujayralar biologiyasi, nevrologiya va farmakologiya sohalarida muhim tadqiqot usuli hisoblanadi.
1. Ikki fotonli mikroskopiyaning paydo bo'lishi foni - an'anaviy lazerli konfokal mikroskopiyaning ikkita cheklovi:
1) Ulardan biri fototoksiklik hodisasi: chunki konfokal pin teshigi yuqori aniqlikdagi tasvirni olish uchun etarlicha kichik bo'lishi kerak va kichik diafragma namunadan chiqariladigan floresansning katta qismini, shu jumladan fokus tekisligidan chiqadigan floresansni to'sib qo'yadi, mos keladigan Ha, qo'zg'atuvchi yorug'lik etarli signal-shovqin nisbatini olish uchun etarlicha kuchli bo'lishi kerak; va yuqori intensiv lazer lyuminestsent bo'yoqning uzluksiz skanerlashda tez so'nishiga olib keladi va skanerlash jarayonida floresan signal zaif va zaifroq bo'ladi.
2) Fototoksiklik yana bir muammo. Lazer nurlanishi ostida ko'plab lyuminestsent bo'yoq molekulalari yagona kislorod yoki erkin radikallar kabi sitotoksinlarni ishlab chiqaradi, shuning uchun skanerlash vaqti va qo'zg'atuvchi nurning optik quvvat zichligi namuna zichligini saqlab qolish uchun eksperimentda cheklanishi kerak. faol. Faol namunalar bo'yicha tadqiqotlarda, ayniqsa faol namunalarning o'sishi va rivojlanishining turli bosqichlari, fotooqartirish va fototoksiklik bu tadqiqotlarni juda cheklangan qiladi.
2. Nima uchun ikki fotonli mikroskoplar odatda ultrabinafsha qo'zg'atuvchi lazerlar bilan jihozlanishi shart emas deb aytasiz?
Ikki fotonli mikroskop - bu ikki fotonli qo'zg'alish effektiga asoslangan floresan qo'zg'atish texnologiyasi: floresan bo'yoq molekulalari bir vaqtning o'zida ikkita kam energiyali fotonni yutish orqali qo'zg'atilishi mumkin (flüoresan molekulalarga yetib boradigan ikkita foton orasidagi vaqt oralig'i 1 femtosekunddan kam. ), uning qo'zg'atuvchi effekti to'lqin uzunligi 1/2 bo'lgan yuqori energiyali fotonni yutish bilan teng bo'lishi mumkin. Masalan, qizil to'lqin uzunliklarida ikkita fotonni yutish ultrabinafsha nurni yutuvchi molekulaga teng. Uzoq to'lqinli fotonlar hujayralar tomonidan oson so'rilmaydi, shuning uchun tirik hujayralar uchun fototoksiklik kamayadi va fotooqartirish ham kamayadi. Shunday qilib, u nafaqat ultrabinafsha qo'zg'alish funktsiyasini bajaradi, balki ultrabinafsha nurlarning namunaga zarar etkazishini ham oldini oladi.
3. Ikki fotonli mikroskopning lazerining o‘ziga xos xususiyati nimada?
Ikki fotonli yutilish ehtimoli ikki fotonning fazoda va vaqtda qanchalik yaqin kelishiga bog'liq (ikki foton 10-18 soniya ichida kelishi kerak). Ikki fotonli yutilish kesimi kichik va faqat katta foton oqimi bo'lgan hududlardagi ftoroforlar qo'zg'aladi. Shuning uchun ishlatiladigan lazerlarning ko'pchiligi titanium safir lazerlari bo'lib, ular pikosoniya yoki femtosekundlik skanerlash tezligiga erisha oladi va juda yuqori tepalik kuchiga va past o'rtacha quvvatga ega, shuning uchun fotooqartirish va fototoksiklikni kamaytirish yoki yo'q qilish mumkin. Eng muhimi, ikkita fotonning bir vaqtning o'zida qo'zg'alishini ta'minlaydigan kichik diapazonda fotonlarning juda yuqori zichligini ta'minlashdir.
4. Ikki fotonli qo'zg'alishning afzalliklari nimada?
1) Bo'yoqning selektivligini oshiring: konfokal tizim lazerining (Ar, Ar/Kr, HeNe) qo'zg'atuvchi yorug'lik diapazoni 488nm - 647nm. Bu UV qo'zg'atuvchi floresan bo'yoqlar bilan tajriba o'tkazishni anglatadi, masalan, DAPI , Hoescht bilan. Ikki fotonning qo'zg'alish to'lqin uzunligi bir fotonnikidan ikki baravar ko'p, shuning uchun ultrabinafsha bilan qo'zg'atilgan bo'yoqlar yaqin infraqizil nurda qo'zg'alishi mumkin.
2) Fotooqartirishni kamaytiring: Fotooqartirishning kamayishi tufayli floresan rezonans energiyasini uzatish (FRET) uchun CFP/YFP yordamida tajribalarning muvaffaqiyat darajasi oshadi.
3) Maxsus ob'ektiv linzalar talab qilinmaydi: Uskuna nuqtai nazaridan, yaqin infraqizil nurning to'lqin uzunligi bilan UV qo'zg'atuvchi bo'yoqlarning qo'zg'alishi maxsus UV optik komponentlarini talab qilmaydi.
4) Signal-shovqin nisbatini yaxshilang: qo'zg'atuvchi yorug'lik to'lqin uzunligi va chiqarilgan yorug'lik to'lqin uzunligi katta farqga ega, bu signal-shovqin nisbatini yaxshilaydi.
5) Fokus nuqtasiga lokalizatsiya qilingan oqartirish: floresan qo'zg'alishi faqat ob'ektivning markazlashtirilgan nuqtasida sodir bo'lganligi sababli, konfokal pin teshigiga ehtiyoj yo'q. Bu yorug'likni aniqlashni yaxshilaydi va fotosuratlarni oqartirish faqat fokus nuqtasida sodir bo'ladi.
6) Namunalarga kirish osonroq: infraqizil to'lqin uzunligidagi yorug'lik hujayralar tomonidan osongina tarqalmaydi va chuqurroq namunalarga kirib borishi mumkin.
5. Lazerli skanerlash konfokal mikroskopiya bilan solishtirganda, ikki fotonli mikroskopning eng katta yaxshilanishi nimada?
1) Fotooqartirishning kamayishi.
2) fototoksiklikning kamayishi.
3) Tarqalishi oson emas va qalin namunalarga, masalan, miya bo'laklariga kirib borish osonroq.
