Floresan mikroskopiya tamoyillari
Floresan mikroskoplari oddiy optik mikroskoplardan farq qiladi. Oddiy yorug'lik manbalarining yoritilishi ostida namunalarni kuzatish o'rniga, ular floresan chiqarish uchun mikroskop ostida namunalardagi lyuminestsent moddalarni qo'zg'atish uchun ma'lum bir to'lqin uzunlikdagi yorug'likdan (odatda ultrabinafsha nur, ko'k-binafsha nur) foydalanadilar. Shuning uchun lyuminestsent mikroskopning yorug'lik manbai to'g'ridan-to'g'ri yorug'lik sifatida emas, balki namunadagi floresan moddalarni qo'zg'atuvchi energiya manbai sifatida ishlaydi. Namunani kuzatishimiz mumkin bo'lgan sabab yorug'lik manbasining yoritilishi bilan bog'liq, ammo namunadagi lyuminestsent moddadan keyin taqdim etilgan flüoresan fenomeni hayajonlangan yorug'lik energiyasini o'zlashtiradi.
Ko'rinib turibdiki, lyuminestsent mikroskopning o'ziga xos xususiyati shundaki, uning yorug'lik manbai ma'lum bir to'lqin uzunligi diapazonida ko'p miqdorda qo'zg'atuvchi yorug'lik berishi mumkin, shuning uchun sinovdan o'tgan namunadagi floresan moddasi zarur intensivlikdagi qo'zg'atuvchi nurni olishi mumkin. Shu bilan birga, floresan mikroskop mos keladigan filtr tizimiga ega bo'lishi kerak.
Floresan mikroskopiya immunofluoresans gistokimyosida muhim vositadir. U ultra yuqori kuchlanishli yorug'lik manbai, filtr tizimi (shu jumladan qo'zg'atish va bostirish filtri plitasi), optik tizim va fotografiya tizimi va boshqa asosiy komponentlardan iborat. U floresansni chiqarish uchun namunani qo'zg'atish uchun ma'lum bir to'lqin uzunligidagi yorug'likdan foydalanadi.
Floresansiyani qo'zg'atish usuli: yorug'likning to'lqin uzunligi diapazoniga ko'ra, uni ikki turga bo'lish mumkin: UV qo'zg'atish usuli (ultrabinafsha yoritish usuli yordamida) va BV qo'zg'atish usuli (ko'k-binafsha nur yordamida). UV qo'zg'atish usuli qo'zg'atish uchun 400 nm dan qisqaroq ultrabinafsha nurlardan foydalanadi. Ushbu usulda ko'rinadigan qo'zg'atuvchi yorug'lik yo'q, shuning uchun kuzatilgan floresans bo'yoqning o'ziga xos flüoresansini ko'rsatadi va namunadagi o'ziga xos flüoresansni fon to'qimalarining avtoflüoresansiyasidan ajratish oson.
BV qo'zg'atish usuli ultrabinafshadan ko'k nurgacha qo'zg'atish uchun 404 nm va 434 nm ga asoslangan. Ushbu usul namunani nurlantirish uchun ko'k chiroqdan foydalanadi, shuning uchun lyuminestsent kuzatuv tizimining kesish filtri ko'k chiroqni to'liq to'sib qo'yadigan va kerakli yashil va sariq floresanlarni to'liq o'tkaza oladigan filtrdan foydalanishi kerak. Floresan antikor tahlillari uchun floresan bo'yoqlar. Qo'zg'atuvchi yorug'likning maksimal yutilish to'lqin uzunligi floresansning maksimal emissiya to'lqin uzunligiga nisbatan yaqin, shuning uchun BV qo'zg'alish usulida ishlatiladigan filtr keskin kesish filtridan foydalanishi kerak. Ushbu usul ko'k nurni qo'zg'atuvchi yorug'lik sifatida ishlatishi mumkin, shuning uchun lyuminestsent pigmentning yutilish samaradorligi yuqori bo'ladi va yorqinroq tasvirni olish mumkin. Uning kamchiligi shundaki, 500 nm dan past bo'lgan floresans ko'rinmaydi va 500 nm dan yuqori floresans butun tasvirni sariq rangga aylantiradi. Floresan antikor usulida ftoroxromning o'ziga xosligi ko'pincha floroxromga xos rang bilan baholanadi. Shuning uchun, nozik o'ziga xoslik haqida gapirganda, BV qo'zg'atish usulining yuqorida ko'rsatilgan kamchiliklari ko'pincha katta ta'sir ko'rsatadi.
Xulosa qilib aytadigan bo'lsak, lyuminestsent mikroskopning yoritilishini kondensatorning tuzilishi va qo'zg'atuvchi nurning to'lqin uzunligiga ko'ra quyidagi uchta nuqtaga ko'ra ko'rib chiqish mumkin.
① Floresan tasvirning kontrast talablari nuqtai nazaridan, yorug'lik uchun UV qo'zg'atuvchi qorong'u maydon konsentratori ishlatiladi.
② Tasvirning yorqinligini hisobga olgan holda, BV qo'zg'atuvchi filtr eng yuqori qorong'u maydonni kuzatish samaradorligiga ega.
③UV qo'zg'alish filtri qorong'i maydonni kuzatish va BV qo'zg'atuvchi qorong'u maydon kontsentratorining yoritilishining xususiyatlari ushbu ikkita yoritish usuli o'rtasida ko'rib chiqilishi mumkin, ammo birinchisi kuchliroq qorong'i maydon xususiyatlariga ega va yorqinroq tasvirlarni namoyish etadi. Kontrast kichik; ikkinchisi qorong'u maydon yorug'lik yo'lining xususiyatlarini saqlab qoladi, shuning uchun ko'rsatilgan tasvir quyuqroq bo'ladi va kontrast yaxshilanadi. Flüoresan mikroskopdan haqiqatda foydalanilganda, kuzatish uchun namunaning talablariga eng mos keladigan yoritish usuli qo'llanilishi kerak.
Shuni ta'kidlash kerakki, eng yaxshi kontrastga ega bo'lgan UV qo'zg'atuvchi qorong'u maydon kondensatori yoritilgan bo'lsa ham, ultrabinafsha qo'zg'alish nurining namuna tomonidan sindirilgan yoki sochilgan qismi ob'ektiv ob'ektivga kiradi. Avtofluoresans tasvirning javobini yomonlashtirishi mumkin. Shuning uchun, ultrabinafsha nurlarini yutuvchi filtrni kesuvchi filtr sifatida okulyar oldida ishlatish kerak.
