Ikki fotonli floresan mikroskopning afzalliklari juda ko'p
1) Uzoq to'lqinli yorug'lik qisqa to'lqinli yorug'likdan ko'ra tarqalishdan kamroq ta'sir qiladi va namunaga osongina kirib boradi;
2) Fokus tekisligidan tashqaridagi lyuminestsent molekulalar hayajonlanmaydi, bu qo'zg'atuvchi yorug'likning fokus tekisligiga etib borishiga imkon beradi, qo'zg'atuvchi nurning chuqurroq namunalarga kirib borishiga imkon beradi;
3) Uzoq to'lqinli yaqin infraqizil nurlar hujayralar uchun qisqa to'lqinli yorug'likka qaraganda kamroq zaharli;
4) Ikki fotonli mikroskop yordamida namunalarni kuzatayotganda, fotooqartirish va fototoksiklik faqat fokus tekisligida sodir bo'ladi. Shuning uchun ikkita fotonli mikroskoplar bitta fotonli mikroskoplarga qaraganda qalin namunalarni kuzatish, tirik hujayralarni kuzatish yoki qat'iy nuqtali fotosuratlarni oqartirish tajribalarini o'tkazish uchun ko'proq mos keladi.
Konfokal floresan mikroskopiya haqida bilim
Konfokal floresan mikroskopiyaning asosiy printsipi: Fokus tekisligida kichik, yaxshi aniqlangan yorug'lik nuqtasini hosil qilish uchun namunani yoritish uchun nuqta yorug'lik manbasidan foydalaning. Yoritilgandan so'ng nuqta tomonidan chiqarilgan floresans ob'ektiv ob'ektiv tomonidan to'planadi va dastlabki yorug'lik yo'li bo'ylab dikroik oynaga qaytariladi. nur ajratgichni tashkil qiladi. Spektrometr floresansni to'g'ridan-to'g'ri detektorga yuboradi. Yorug'lik manbai va detektor oldida pin teshigi mavjud bo'lib, ular mos ravishda yoritish teshigi va aniqlash teshigi deb ataladi. Ikkalasining geometrik o'lchamlari bir xil, taxminan 100-200nm; fokus tekisligidagi yorug'lik nuqtasiga nisbatan, ikkalasi konjugat, ya'ni yorug'lik nuqtasi bir qator linzalar orqali o'tadi va oxir-oqibat yorug'lik teshigi va aniqlash pin teshigiga bir vaqtning o'zida qaratilishi mumkin. Shunday qilib, fokus tekisligidan keladigan yorug'lik aniqlash teshigi ichida to'planishi mumkin, shu bilan birga fokus tekisligidan yuqoridan yoki pastdan tarqalgan yorug'lik aniqlash teshigidan tashqarida bloklanadi va tasvirni olish mumkin emas. Namuna lazer yordamida nuqtama-nuqta skanerdan o'tkaziladi va aniqlash teshigi orqasidagi fotoko'paytiruvchi trubka ham mos keladigan yorug'lik nuqtasining konfokal tasvirini oladi, u raqamli signalga aylanadi va kompyuterga uzatiladi va nihoyat yig'iladi. ekranda butun fokus tekisligining aniq konfokal tasviriga aylantiring. .
Har bir fokus tekisligi tasviri aslida namunaning optik kesmasi hisoblanadi. Ushbu optik kesma har doim ma'lum bir qalinlikka ega va optik nozik kesma deb ham ataladi. Fokusdagi yorug'lik intensivligi fokussiz yorug'lik intensivligidan ancha katta bo'lgani uchun va fokus bo'lmagan tekislikdagi yorug'lik pin teshigi tomonidan filtrlanganligi sababli, konfokal tizimning maydon chuqurligi taxminan nolga teng. Z o'qi yo'nalishi bo'yicha skanerlash optik tomografiyani amalga oshirishi mumkin, bu esa kerakli shaklni hosil qiladi. XY tekislik (fokal tekislik) skanerlashni Z o'qi (optik o'q) skanerlash bilan birlashtirib, ikki o'lchovli tasvirlarning uzluksiz darajalarini to'plash va ularni maxsus kompyuter dasturlari yordamida qayta ishlash orqali namunaning uch o'lchovli tasvirini olish mumkin.
Ya'ni, aniqlash pin teshigi va yorug'lik manbai teshigi doimo bir xil nuqtaga qaratilgan bo'lib, fokus tekisligidan tashqarida qo'zg'atilgan floresans aniqlash teshigiga kira olmaydi.
Lazer konfokalining ishlash printsipining oddiy ifodasi shundaki, u yorug'lik manbai sifatida lazerdan foydalanadi. An'anaviy floresan mikroskop tasviri asosida lazerli skanerlash moslamasi va konjugat fokuslash moslamasi qo'shiladi va tizim raqamli tasvirlarni yig'ish va qayta ishlash uchun kompyuter tomonidan boshqariladi.
