Konfokal mikroskopiya tamoyillari
Konfokal mikroskop 1980-yillarda paydo bo'lgan va ishlab chiqilgan yuqori aniqlikdagi tasvirlash vositasi bo'lib, submikron tuzilmalarini o'rganish uchun muhim ilmiy tadqiqot vositasidir. Kompyuterlar, tasvirni qayta ishlash dasturlari va lazerlarning rivojlanishi bilan konfokal mikroskoplar ham katta rivojlanishga erishdi va hozirda biologiya, mikrotizimlar va materiallarni o'lchash sohalarida keng qo'llaniladi. Konfokal mikroskop - bu konfokal printsip, skanerlash texnologiyasi va kompyuter grafikasini qayta ishlash texnologiyasini birlashtirgan mikroskopning yangi turi. Uning asosiy afzalliklari: yuqori lateral o'lchamlari va yuqori eksenel o'lchamlari va adashgan yorug'likni samarali bostirish , yuqori kontrast bilan.
Odatiy konfokal mikroskopni o'rnatish o'lchanadigan ob'ektning fokus tekisligining konjugat tekisligiga ikkita kichik teshikni qo'yishdir, ulardan biri yorug'lik manbai oldida, ikkinchisi esa detektor oldida, shaklda ko'rsatilganidek, joylashtiriladi. 1. Rasmdan ko'rinib turibdiki, o'lchangan namuna kvazifokus tekisligida bo'lganda, aniqlash uchi tomonidan to'plangan yorug'lik intensivligi eng katta bo'ladi; o'lchangan namuna fokusdan tashqari holatda bo'lsa, aniqlash oxirida yorug'lik nuqtasi tarqaladi va yorug'lik intensivligi tez kamayadi. Shuning uchun, faqat fokus tekisligidagi nuqtalar chiqaradigan yorug'lik chiqish pin teshigidan o'tishi mumkin, fokus tekisligidan tashqaridagi nuqtalar chiqaradigan yorug'lik esa chiqish pin teshigi tekisligida defokuslanadi va ularning aksariyati markaziy pin teshigidan o'ta olmaydi. Shu sababli, fokus tekisligidagi kuzatuv nishoni yorqin ko'rinadi va kuzatilmaydigan nuqta fon sifatida qora ko'rinadi, kontrastni oshiradi va tasvirni tozalaydi. Tasvirlash jarayonida ikkita pinhona konfokal, konfokal nuqta aniqlangan nuqta va aniqlangan nuqta joylashgan tekislik konfokal tekislikdir.
Konfokal mikroskopda detektordagi teshikning kattaligi hal qiluvchi rol o'ynaydi. Bu tizimning ruxsati va signal-shovqin nisbatiga bevosita ta'sir qiladi. Agar pin teshigi juda katta bo'lsa, konfokal aniqlash effektiga erishilmaydi, bu nafaqat tizimning o'lchamlarini pasaytiradi, balki ko'proq adashgan yorug'likni keltirib chiqaradi; agar pin teshigi juda kichik bo'lsa, u aniqlash samaradorligini pasaytiradi va mikroskopik tasvirni kamaytiradi. yorqinlik. Tadqiqotlar shuni ko'rsatdiki, teshikning diametri Airy diskining diametriga teng bo'lganda, konfokal talablar bajariladi va aniqlash samaradorligi sezilarli darajada kamaymaydi. Teshikning diametri odatda mikron darajasida bo'lganligi sababli, lazer nurining fokus nuqtasi va teshikning holati o'rtasida og'ish bo'lsa, signal buzilishi sodir bo'ladi. Shuning uchun konfokal mikroskoplar odatda avtofokus tizimidan foydalanadi, bu esa o'lchash vaqtini deyarli oshiradi.
Lazerli konfokal skanerlash mikroskopi nuqtali tasvir bo'lganligi sababli, ob'ektning ikki o'lchovli tasvirini olish uchun x va y yo'nalishlarida ikki o'lchovli skanerlashdan foydalanish kerak. Turli mikroskoplar turli xil skanerlash usullaridan foydalanadi:
(1) Ob'ektni skanerlash. Ya'ni, ob'ektning o'zi ma'lum bir qonunga muvofiq harakat qiladi, yorug'lik nuri esa o'zgarishsiz qoladi. Afzalliklari: barqaror optik yo'l; Kamchiliklari: katta skanerlash jadvali talab qilinadi, shuning uchun skanerlash tezligi juda cheklangan.
(2) Nurni skanerlash tizimi aks ettiruvchi galvanometr yordamida hosil bo'ladi. Ya'ni, skanerlash galvanometrini boshqarish orqali, ikki o'lchovli skanerlashni yakunlash uchun fokuslangan yorug'lik nuqtasi muntazam ravishda ob'ektning ma'lum bir qatlamiga aks ettiriladi. Uning afzalligi shundaki, u yuqori aniqlikka ega va ko'pincha yuqori aniqlikdagi o'lchash uchun ishlatiladi. Ob'ektni skanerlashdan ko'ra skanerlash tezligi yaxshilandi, lekin u hali ham tez emas.
(3) Skanerlash uchun akusto-optik burilish elementidan foydalaning va skanerlash tovush to'lqinining chiqish chastotasini o'zgartirish va keyin yorug'lik to'lqinining uzatish yo'nalishini o'zgartirish orqali amalga oshiriladi. Uning ajoyib afzalligi shundaki, skanerlash tezligi juda tez. Qo'shma Shtatlar tomonidan ishlab chiqilgan skanerlash tizimi real vaqtda video tasvirlarni yaratish uchun akusto-optik deflektordan foydalanadi. Ikki o'lchovli tasvirni skanerlash uchun atigi 1/30 soniya kerak bo'ladi va u deyarli real vaqtda chiqishga erishadi.
(4) Nipkow diskini skanerlash. Skanerlash jarayoni Nipkow diskini aylantirish va boshqa komponentlarni harakatsiz saqlash orqali yakunlanadi. Uni bir vaqtning o'zida tasvirlash mumkin va tezligi juda tez. Biroq, tasvir nuri o'qdan tashqari yorug'lik bo'lganligi sababli, linzalarning eksadan tashqari aberatsiyasini tuzatish kerak va yorug'lik energiyasidan foydalanish darajasi juda past.
