Oddiy mikroskop va floresan mikroskop o'rtasidagi farq
Floresan mikroskoplari tekshiriladigan ob'ektni nurlantirish uchun yorug'lik manbai sifatida ultrabinafsha nurlardan foydalanadi, shunda ob'ekt yorug'lik chiqaradi va keyin mikroskop ostida ob'ektni kuzatadi. U asosan immunofluoresans hujayralari uchun ishlatiladi. U asosan yorug'lik manbai, filtr plitasi tizimi va ko'zoynak va ob'ektiv linzalarni kattalashtirish orqali namunaning floresan tasvirini kuzatish uchun optik tizimdan iborat. Keling, ushbu floresan mikroskop va oddiy optik mikroskop o'rtasidagi farqni ko'rib chiqaylik.
1. Yoritish usullari bo'yicha
Floresan mikroskopining yoritish usuli odatda episkopikdir, ya'ni yorug'lik manbai ob'ektiv linzalar orqali sinov namunasiga proyeksiyalanadi.
2. Rezolyutsiya jihatidan
Floresan mikroskoplari yorug'lik manbai sifatida ultrabinafsha nurlardan foydalanadi. To'lqin uzunligi nisbatan qisqa, lekin o'lchamlari oddiy optik mikroskoplarga qaraganda yuqori.
3. Filtrdagi farq
Floresan mikroskop ikkita maxsus filtrdan foydalanadi, ular yorug'lik manbai oldida ko'rinadigan yorug'likni filtrlash uchun ishlatiladi va ob'ektiv linzalar va okulyar o'rtasida ultrabinafsha nurlarni filtrlash uchun ishlatiladi, bu esa inson ko'zlarini himoya qiladi.
Floresan mikroskop ham optik mikroskopning bir turi bo'lib, asosan flüoresan mikroskop tomonidan qo'zg'atilgan to'lqin uzunligi qisqa bo'ladi, shuning uchun bu floresan mikroskop va oddiy mikroskop o'rtasidagi tuzilish va foydalanishdagi farqga olib keladi. Ko'pgina lyuminestsent mikroskoplar zaif nurni ushlab turishning yaxshi funktsiyasiga ega, shuning uchun juda zaif floresan ostida uning tasvirlash qobiliyati ham yaxshi. So'nggi yillarda floresan mikroskoplarning doimiy takomillashtirilishi bilan bir qatorda shovqin ham sezilarli darajada kamaydi. Shuning uchun ko'proq floresan mikroskoplardan foydalaniladi.
Ikki fotonli floresan mikroskopiya haqida ma'lumot
Ikki fotonli qo'zg'alishning asosiy printsipi: yuqori foton zichligi bo'lsa, lyuminestsent molekulalar bir vaqtning o'zida ikkita uzun to'lqinli fotonni o'zlashtira oladi va qo'zg'aluvchan holat deb ataladigan qisqa vaqtdan keyin qisqaroq to'lqinli fotonni chiqaradi. . ; effekt floresan molekulani qo'zg'atish uchun to'lqin uzunligi yarmi uzun to'lqin uzunligi bo'lgan fotonni ishlatish bilan bir xil. Ikki fotonli qo'zg'alish yuqori foton zichligini talab qiladi. Hujayralarga zarar bermaslik uchun ikki fotonli mikroskop yuqori energiyali rejimda qulflangan impulsli lazerlardan foydalanadi. Ushbu lazer tomonidan chiqariladigan lazer yuqori cho'qqi energiyasiga va past o'rtacha energiyaga ega, uning puls kengligi atigi 100 femtosekundni tashkil qiladi va uning chastotasi 80 dan 100 megahertzgacha yetishi mumkin. Impulsli lazerning fotonlarini fokuslash uchun yuqori raqamli diafragma ob'ektiv linzalaridan foydalanganda, ob'ektiv linzaning markazlashtirilgan nuqtasida foton zichligi eng yuqori bo'ladi va ikki fotonli qo'zg'alish faqat ob'ektiv linzaning markazlashtirilgan nuqtasida sodir bo'ladi, shuning uchun ikki fotonli mikroskopga konfokal pin teshigi kerak emas, bu Flüoresansni aniqlash samaradorligini oshiradi.
Umumiy floresan hodisalarida, qo'zg'atuvchi yorug'likning past foton zichligi tufayli, floresan molekula bir vaqtning o'zida faqat bitta fotonni o'zlashtirishi mumkin va keyin bir fotonli floresan bo'lgan radiatsiyaviy o'tish orqali floresan fotonni chiqaradi. Yorug'lik manbai sifatida lazerdan foydalangan holda floresan qo'zg'atish jarayoni uchun ikki fotonli yoki hatto ko'p fotonli floresans paydo bo'lishi mumkin. Bu vaqtda ishlatiladigan qo'zg'atuvchi yorug'lik manbasining intensivligi yuqori va foton zichligi bir vaqtning o'zida ikkita fotonni o'zlashtiradigan floresan molekulalarning talablariga javob beradi. Umumiy lazerni qo'zg'atuvchi yorug'lik manbai sifatida ishlatish jarayonida foton zichligi hali ham ikki fotonli yutilish hodisasini ishlab chiqarish uchun etarli emas. Odatda, femtosekundli impulsli lazer ishlatiladi va uning bir lahzali kuchi megavattgacha bo'lishi mumkin. Shuning uchun, ikki fotonli floresansning to'lqin uzunligi qo'zg'atuvchi yorug'likning to'lqin uzunligidan qisqaroqdir, bu qo'zg'alish to'lqin uzunligining yarmida qo'zg'alish natijasida hosil bo'lgan effektga teng.
Ikki fotonli floresan mikroskopning ko'pgina afzalliklari bor:
1) Uzoq to'lqinli yorug'lik qisqa to'lqinli yorug'likdan ko'ra tarqalishdan kamroq ta'sir qiladi va namunaga osongina kiradi;
2) Fokus tekisligidan tashqaridagi lyuminestsent molekulalar hayajonlanmaydi, shuning uchun ko'proq qo'zg'atuvchi yorug'lik fokus tekisligiga etib borishi mumkin, shuning uchun qo'zg'atuvchi yorug'lik chuqurroq namunalarga kirishi mumkin;
3) Uzoq to'lqinli yaqin infraqizil nurlar hujayralar uchun qisqa to'lqinli yorug'likka qaraganda kamroq zaharli;
4) Namunalarni kuzatish uchun ikki fotonli mikroskopdan foydalanganda, fotooqartirish va fototoksiklik faqat fokus tekisligida sodir bo'ladi. Shuning uchun ikkita fotonli mikroskop qalin namunalarni kuzatish, tirik hujayralarni kuzatish yoki nuqtali fotooqartirish tajribalari uchun bitta fotonli mikroskopga qaraganda ko'proq mos keladi.
Konfokal floresan mikroskopiya haqida bilim
Konfokal floresan mikroskopiyaning asosiy printsipi: namunani nurlantirish uchun nuqtali yorug'lik manbai ishlatiladi va fokus tekisligida aniq belgilangan kichik yorug'lik nuqtasi hosil bo'ladi. ajratuvchilardan tashkil topgan. Nurni ajratuvchi floresansni to'g'ridan-to'g'ri detektorga yuboradi. Yorug'lik manbai va detektor oldida pin teshigi mavjud bo'lib, ular mos ravishda yoritish teshigi va aniqlash teshigi deb ataladi. Ikkalasining geometrik kattaligi bir xil, taxminan 100-200nm; fokus tekisligidagi yorug'lik nuqtasiga nisbatan, ikkalasi konjugat, ya'ni yorug'lik nuqtasi bir qator linzalardan o'tadi va nihoyat, bir vaqtning o'zida yorug'lik teshigi va aniqlash pin teshigiga qaratilishi mumkin. Shunday qilib, fokus tekisligidan keladigan yorug'lik aniqlash teshigi doirasida birlashtirilishi mumkin, shu bilan birga fokus tekisligining yuqoridan yoki ostidan tarqalgan yorug'lik aniqlash teshigidan tashqarida bloklanadi va tasvirni olish mumkin emas. Lazer namunani nuqtama-nuqta skanerdan o'tkazadi va pin teshigini aniqlagandan so'ng, fotoko'paytiruvchi trubka ham mos keladigan yorug'lik nuqtasining konfokal tasvirini oladi, bu raqamli signalga aylantiriladi va kompyuterga uzatiladi va nihoyat aniq tasvirga yig'iladi. ekrandagi butun fokus tekisligining konfokal tasviri.
Har bir fokus tekisligi tasviri aslida namunaning optik kesmasi hisoblanadi. Ushbu optik kesma har doim ma'lum bir qalinlikka ega, shuningdek, optik nozik qism deb ham ataladi. Fokus nuqtasidagi yorug'lik intensivligi fokussiz nuqtadagi yorug'likdan ancha katta bo'lgani uchun va fokus bo'lmagan tekislikdagi yorug'lik pin teshigi tomonidan filtrlanganligi sababli, konfokal tizimning maydon chuqurligi taxminan nolga teng va Z bo'ylab skanerlash. -eksa optik tomografiyani amalga oshirishi mumkin, namunaning fokuslangan joyida ikki o'lchovli optik qismni kuzating. XY tekisligi (fokal tekisligi) skanerlashni Z-o'qi (optik o'q) skanerlash bilan birlashtirib, namunaning uch o'lchovli tasvirini doimiy qatlamlarning ikki o'lchovli tasvirlarini to'plash va maxsus kompyuter dasturlari yordamida qayta ishlash orqali olish mumkin.
Ya'ni, aniqlash pin teshigi va yorug'lik manbai teshigi doimo bir xil nuqtaga qaratilgan bo'lib, fokus tekisligidan tashqarida qo'zg'atilgan floresans aniqlash teshigiga kira olmaydi.
Lazerli konfokalning ishlash printsipining oddiy ifodasi shundaki, u yorug'lik manbai sifatida lazerdan foydalanadi va an'anaviy floresan mikroskopni tasvirlash asosida lazerli skanerlash moslamasi va konjugat fokuslash moslamasini qo'shadi va raqamli tasvirni olish tizimi va kompyuter boshqaruvi orqali qayta ishlash.
