Konfokal mikroskop va oddiy optik mikroskop o'rtasidagi taqqoslash
Umumiy optik mikroskop
Umumiy biologik mikroskop uch qismdan iborat, xususan: ① yorug'lik manbai va kondensatorni o'z ichiga olgan yoritish tizimi; ② Ob'ektiv linza va okulyardan iborat optik kuchaytirish tizimi mikroskopning asosiy qismidir. Sferik aberatsiya va xromatik aberatsiyani bartaraf etish uchun ikkala ko'zoynak va ob'ektiv linzalar murakkab linzalar guruhlaridan iborat; (3) materiallarni mahkamlash va qulay kuzatish uchun ishlatiladigan mexanik qurilma.
Mikroskop tasvirining aniq yoki aniq emasligi nafaqat kattalashtirishga, balki mikroskopning aniqligiga ham bog'liq. Ruxsat mikroskopning (yoki inson ko'zlari nishondan 25 sm uzoqda joylashgan joyi) zui ob'ektining kichik oralig'ini ajrata olish qobiliyatini anglatadi. Ruxsat yorug'likning to'lqin uzunligiga, diafragma nisbatiga va muhitning sinishi indeksiga bog'liq bo'lib, u formula bilan ifodalanadi:
R=0.61l /N．A. N．A＝ｎsin /2
Bu yerda: n= muhitning sindirish ko'rsatkichi;=oyna burchagi (namunaning linza diafragmasiga ochilish burchagi) va NA= raqamli diafragma. Oyna burchagi har doim 180 dan kichikmi? Shuning uchun sina/2 ning zui qiymati 1 dan kichik bo'lishi kerak.
Optik linzalarni tayyorlash uchun ishlatiladigan oynaning sinishi indeksi 1,65 ~ 1,78 ni tashkil qiladi va ishlatiladigan muhitning sinishi ko'rsatkichi shishanikiga yaqinroq bo'lsa, shuncha yaxshi bo'ladi. Quruq ob'ektiv uchun vosita havodir va diafragma nisbati odatda 0.05 ~ 0,95; Yog 'linzalari vosita sifatida xushbo'y asfaltdan foydalanadi va linzalarning ochilish tezligi 1,5 ga yaqin bo'lishi mumkin.
Oddiy yorug'likning to'lqin uzunligi 4 00 ~ 700 nm, shuning uchun mikroskopning o'lchamlari 0,2 mm dan kam emas va inson ko'zining o'lchamlari 0,2 mm, shuning uchun zui ning katta kattalashishi tomonidan ishlab chiqilgan. umumiy mikroskop odatda 1000X x.
Nima uchun konfokal mikroskop kerak?
1. Optik mikroskop buyuk salaflarimizning sa'y-harakatlari va takomillashuvi tufayli takomillashtirildi. Darhaqiqat, oddiy mikroskoplar bizga go'zal mikroskopik tasvirlarni oddiy va tez taqdim etishi mumkin. Biroq, bu deyarli mukammal mikroskop dunyosiga inqilobiy yangilik olib kelgan voqea sodir bo'ldi, bu "lazerli skanerlash konfokal mikroskop" ixtirosi. Ushbu yangi mikroskop optik tizimni qabul qilish bilan tavsiflanadi, u faqat fokus to'plangan tekislikdagi tasvir ma'lumotlarini chiqaradi va fokusni o'zgartirganda olingan ma'lumotni tasvir xotirasida tiklaydi, shunda to'liq uch o'lchovli ma'lumotga ega yorqin tasvir paydo bo'ladi. olish mumkin. Bu usul yordamida oddiy mikroskoplar tomonidan tasdiqlana olmaydigan sirt shakli haqidagi ma'lumotlarni oddiygina olish mumkin. Bundan tashqari, oddiy optik mikroskoplar uchun "ravshanlikni yaxshilash" va "fokus chuqurligini chuqurlashtirish" qarama-qarshi shartlar, ayniqsa yuqori kattalashtirishda, ammo konfokal mikroskoplar uchun bu muammo hal qilinadi.
2. Konfokal optik tizimning afzalliklari
Konfokal optik tizim namuna nuqtasini yoritadi va aks ettirilgan yorug'lik nuqta retseptorlari tomonidan ham qabul qilinadi. Namuna fokus holatiga qo'yilganda deyarli barcha aks ettirilgan yorug'lik fotoreseptorga etib borishi mumkin, ammo namuna fokusdan chetga chiqqanda, aks ettirilgan yorug'lik fotoreseptorga etib bormaydi. Ya'ni, konfokal optik tizimda faqat fokusga to'g'ri keladigan tasvir chiqariladi va fakula va keraksiz tarqalgan yorug'lik himoyalanadi.
3. Nima uchun lazerdan foydalanish kerak?
Konfokal optik tizimda namuna yoritiladi va aks ettirilgan yorug'lik nuqtali fotoreseptor tomonidan ham qabul qilinadi. Shuning uchun nuqta yorug'lik manbai zarur bo'ladi. Lazer juda nuqtali yorug'lik manbasiga tegishli. Ko'pgina hollarda, konfokal mikroskopning yorug'lik manbai lazer yorug'lik manbasini qabul qiladi. Bundan tashqari, lazerning monoxromatikligi, yo'nalishi va mukammal nur shakli kabi xususiyatlari ham uni keng qo'llashning muhim sabablari hisoblanadi.
4. Yuqori tezlikda skanerlash asosida real vaqt rejimida kuzatish mumkin bo'ladi.
Lazerli skanerlashda gorizontal yo'nalishda akustik optik deflektor (AO asosiy elementi) va vertikal yo'nalishda Servo Galvano-oyna ishlatiladi. Akustik optik burilish blokida mexanik tebranish qismi yo'qligi sababli, u yuqori tezlikda skanerlashi mumkin va monitoring ekranida real vaqtda kuzatish mumkin. Ushbu kameraning yuqori tezligi diqqatni jamlash va pozitsiyani olish tezligiga bevosita ta'sir qiluvchi juda muhim loyihadir.
5. Fokus holati va yorqinlik o'rtasidagi bog'liqlik
Konfokal optik tizimda namuna fokus holatiga to'g'ri joylashtirilganda yorqinlik katta bo'ladi va undan oldin va keyin uning yorqinligi keskin pasayadi (4-rasmdagi qattiq chiziq). Fokus tekisligining bu sezgir selektivligi, shuningdek, konfokal mikroskopning balandlik yo'nalishini o'lchash va fokus chuqurligini kengaytirish tamoyilidir. Bundan farqli o'laroq, oddiy optik mikroskop fokus holatidan oldin va keyin aniq yorqinlik o'zgarishiga ega emas (4-rasmdagi nuqta chiziq).
6. Yuqori kontrast va yuqori aniqlik
Umumiy optik mikroskopda fokusdan chetga chiqqan aks ettirilgan yorug'lik xalaqit beradi va u fokus tasvirlash qismi bilan bir-biriga yopishadi va shu bilan tasvir kontrastini pasaytiradi. Aksincha, konfokal optik tizimda fokusdan tashqarida tarqalgan yorug'lik va ob'ektiv linzalari ichidagi tarqalgan yorug'lik deyarli butunlay yo'q qilinadi, shuning uchun juda yuqori kontrastli tasvirni olish mumkin. Bundan tashqari, yorug'lik ob'ektiv linzadan ikki marta o'tganligi sababli, birinchi navbatda nuqta tasviri keskinlashadi va mikroskopning aniqligi ham yaxshilanadi.
7. Optik lokalizatsiya funksiyasi
Konfokal optik tizimda markazdan boshqa qismning aks ettirilgan nuri mikroporlar bilan himoyalangan. Shuning uchun, uch o'lchovli namunani kuzatishda, namunani fokus bilan kesishdan keyin hosil bo'lgan tasvir hosil bo'ladi (5-rasm). Ushbu effekt optik lokalizatsiya deb ataladi, bu konfokal optik tizimning mutaxassisliklaridan biriga tegishli.
8. Fokus harakatlanuvchi xotira funksiyasi
Fokusdan tashqarida aks ettirilgan yorug'lik mikroporlar tomonidan himoyalangan. Boshqa tomondan, konfokal optik tizim tomonidan yaratilgan tasvirning barcha nuqtalari fokus bilan mos keladi deb hisoblash mumkin. Shuning uchun, agar uch o'lchamli namuna Z-o'qi (optik o'q) yo'nalishi bo'ylab harakatlantirilsa, tasvir to'planadi va xotirada saqlanadi va zui oxir-oqibat butun namuna va fokusning tasodifiyligi natijasida hosil bo'lgan tasvirni oladi. . Shu tarzda, cheksiz chuqurlikdagi fokus funktsiyasi mobil xotira funktsiyasi deb ataladi.
9. Yuzaki shaklni o'lchash funktsiyasi
Fokusni harakatlantirish funktsiyasida namunaning sirt shakli balandlikni qayd etish halqasini qo'shish orqali kontaktsiz tarzda o'lchanishi mumkin. Ushbu funktsiyaga asoslanib, har bir pikselda zui ning katta yorqinlik qiymatidan hosil bo'lgan Z o'qi koordinatalarini yozib olish mumkin va bu ma'lumotlarga asoslanib, namunaning sirt shakli bilan bog'liq ma'lumotlarni olish mumkin.
10. Yuqori aniqlikdagi mikro o'lchamli o'lchov funktsiyasi
Yorug'likni qabul qilish moslamasi bir o'lchovli CCD tasvirlash sensorini qabul qiladi, shuning uchun skanerlash moslamasining skanerlash burchagiga ta'sir qilmasligi mumkin, shuning uchun yuqori aniqlikdagi o'lchov tugallanishi mumkin. Bunga qo'shimcha ravishda, bir vaqtning o'zida sozlanishi fokus chuqurligi bilan diqqat markazida harakatlanuvchi xotira funksiyasi qabul qilinganligi sababli, fokus ofsetidan kelib chiqqan o'lchash xatosi yo'q qilinishi mumkin.
11. Uch o'lchovli tasvirni tahlil qilish
Sirt shaklini o'lchash funktsiyasidan foydalanib, namuna yuzasining uch o'lchovli tasvirini osongina yaratish mumkin. Nafaqat bu, balki ko'plab tahlil turlarini ham amalga oshirish mumkin, masalan: sirt pürüzlülüğünü o'lchash, maydon, hajm, sirt maydoni, aylana, radius, zui uzunligi, perimetr, og'irlik markazi, tomografik tasvir, FFT transformatsiyasi, chiziq. kenglik o'lchovi va boshqalar.
Lazerli konfokal skanerlash mikroskopidan nafaqat hujayra morfologiyasini kuzatish, balki hujayralardagi biokimyoviy komponentlarning miqdoriy tahlili, optik zichlik statistikasi va hujayra morfologiyasini o'lchash uchun ham foydalanish mumkin.
