Bir nechta o'ta aniqlikdagi mikroskopiya usullarini ko'rib chiqish
An'anaviy yorug'lik mikroskopiyasi uchun yorug'likning diffraktsiyasi tasvir o'lchamlarini taxminan 250 nm bilan cheklaydi. Bugungi kunda super-rezolyutsiya texnikasi buni 10 baravardan ko'proq yaxshilashi mumkin. Bu texnikaga asosan uchta usul orqali erishiladi: bitta molekulali lokalizatsiya mikroskopiyasi, jumladan, fotosensitiv lokalizatsiya mikroskopiyasi (PALM) va stokastik optik rekonstruksiya mikroskopiyasi (STORM); tizimli yoritish mikroskopiyasi (SIM); va stimulyatsiyalangan emissiya depletion mikroskopiyasi (STED). Super rezolyutsiya texnologiyasini qanday tanlash kerak - bu hamma uchun qiziq. "Afsuski, qaysi usulni qo'llashni hal qilishning oddiy tamoyillari yo'q", deydi Buyuk Britaniyaning Oksford universitetining doktorlik tadqiqotchisi Metyu Strasi. "Har birining o'ziga xos afzalliklari va kamchiliklari bor." Albatta, olimlar ma'lum bir loyiha uchun to'g'ri usulni qanday tanlashni ham aniqlaydilar. "Bioimaging kontekstida e'tiborga olinishi kerak bo'lgan asosiy omillar quyidagilardir: fazoviy va vaqtinchalik ruxsat, fotozararga sezgirlik, etiketkalash qobiliyati, namuna qalinligi va fon floresansi yoki hujayraning avtolog floresansi." Bu qanday ishlaydi Har xil o'ta aniqlikdagi mikroskoplar turli yo'llar bilan ishlaydi. PALM va STORM holatlarida, lyuminestsent markerlarning faqat kichik bir qismi ma'lum bir vaqtda hayajonlanadi yoki fotoaktivlanadi, bu ularni yuqori aniqlik bilan mustaqil lokalizatsiya qilish imkonini beradi. Ushbu jarayonni barcha lyuminestsent teglar bilan o'tkazish to'liq o'ta aniq tasvirga olib keladi. 2014-yilda kimyo bo‘yicha Nobel mukofoti sovrindorlaridan biri va Maks Plank nomidagi biofizik kimyo instituti direktori Stefan Hell shunday dedi: “PALM/STORM tizimini o‘rnatish nisbatan oson, lekin uni qo‘llash qiyin, chunki lyuminestsent Guruh fotoaktivatsiya qobiliyatiga ega bo'lishi kerak. Cheklovlar Kamchiliklari shundaki, ular hujayra kontekstida bitta lyuminestsent molekulani aniqlashlari kerak va STEDga qaraganda kamroq ishonchli." STED floroforni qo'zg'atish uchun lazer impulsidan va floroforni o'chirish uchun halqa shaklidagi lazerdan foydalanadi va super aniqlik uchun faqat oraliq nanometr o'lchamdagi Flüoresansni qoldiradi. Butun namunani skanerlash tasvirni hosil qiladi. "STED ning afzalligi shundaki, bu tugmachali texnologiyadir", deb tushuntirdi Hell. "U standart konfokal floresan mikroskop kabi ishlaydi." Bundan tashqari, yashil yoki sariq floresan oqsillar va rodamindan olingan bo'yoqlar kabi floroforlar yordamida tirik hujayralarni tasvirlashi mumkin. Parametrik taqqoslash O'ta aniqlikdagi barcha usullar aniqlik bo'yicha an'anaviy yorug'lik mikroskopidan ustun bo'lishiga qaramasdan, ular bir-biridan farq qiladi. SIM-karta o'lchamlarini taxminan ikki baravar oshiradi va 100 nm ga etadi. PALM va STORM 15 nm maqsadlarni hal qila oladi. Do'zaxga ko'ra, STED tirik hujayralarda 30 nm va sobit hujayralarda 15 nm fazoviy ruxsatni ta'minlaydi. Muayyan ilovalar haqida gap ketganda, biz signal-shovqin nisbatini ham hisobga olishimiz kerak. Ba'zi hollarda, pastroq piksellar sonini, lekin yuqori SNR teskarisiga qaraganda yaxshiroq tasvirga olib kelishi mumkin (yuqori aniqlik, lekin past SNR). Tasvirni olish tezligi ham juda muhim, ayniqsa tirik hujayralar uchun. "Barcha o'ta rezolyutsiya texnikasi an'anaviy floresan tasvirlash usullaridan sekinroq", dedi Stracy. "PALM/STORM - eng sekin, bitta tasvirni olish uchun o'n minglab kadrlar kerak, SIM-kartaga o'nlab kadrlar kerak, STED esa skanerlash texnologiyasidir, shuning uchun olish tezligi ko'rish maydonining o'lchamiga bog'liq." Tirik hujayralar yoki sobit Imaging hujayralaridan tashqari, ba'zi olimlar ham ob'ektlar qanday harakatlanishini tushunishni xohlashadi. Stracy nafaqat statik tasvirlarni, balki tirik hujayralardagi biologik tizimlar dinamikasini tushunishga qiziqadi. U tirik hujayralardagi dinamikani tahlil qilish uchun PALMni bitta zarracha kuzatish bilan birlashtiradi. Shu tarzda, u marker molekulalarini o'z vazifalarini bajarayotganini bevosita kuzatishi mumkin. Biroq, uning fikricha, SIM bu dinamik jarayonlarni molekulyar darajada o'rganish uchun mos emas, lekin uning tez olish tezligi tufayli u butun xromosomalar kabi kattaroq tuzilmalarning dinamikasini kuzatish uchun juda mos keladi. Eng so'nggi natijalar 2017 yilda Do'zax jamoasi Fanda MINFLUX o'ta aniqlikdagi mikroskop haqida xabar berdi. Jahannamga ko'ra, bu super-rezolyutsiya usuli birinchi marta 1 nm fazoviy ruxsatga erishadi. Bundan tashqari, u tirik hujayralardagi alohida molekulalarni boshqa usullarga qaraganda kamida 100 marta tezroq kuzatishi mumkin. Boshqa olimlar ham MINFLUX mikroskopini yuqori baholadilar. "Yangi ilovalar va yondashuvlar doimiy ravishda ishlab chiqilmoqda, ammo men uchun ikkita ilg'orlik bor", dedi Shextman. Ulardan biri MINFLUX. "U juda aniq molekulyar joylashishni aniqlash uchun mohir yondashuvdan foydalanadi." Ikkinchi qiziqarli voqea haqida Shextman WE Moerner va uning Stenford universitetidagi hamkasblarini eslatib o'tdi. Moerner, shuningdek, 2014 yilgi kimyo bo'yicha Nobel mukofoti sovrindori bo'lgan. G'oliblardan biri. Flüoresan yagona molekulalarning anizotropik tarqalishidan kelib chiqadigan tasvir o'lchamlari cheklanishini hal qilish uchun olimlar molekulalarning yo'nalishi va holatini aniqlash uchun turli xil qo'zg'alish polarizatsiyalaridan foydalanganlar. Bundan tashqari, ular nozik o'quvchilar sirtini ishlab chiqdilar. Ushbu usullar tuzilmalarni lokalizatsiya qilish qobiliyatini yaxshilaydi. Floresan yorliqlari haqida. Ko'pgina o'ta o'lchamli ilovalarda teglar juda muhimdir. Tegishli mahsulotlarni taqdim etadigan ba'zi kompaniyalar ham mavjud. Misol uchun, Germaniyaning Miltenyi kompaniyasi Stefan Hell tomonidan asos solingan Abberior kompaniyasi bilan hamkorlikda super rezolyutsiyali mikroskop bo'yoqlari uchun maxsus antikor konjugatsiya xizmatlarini taqdim etdi. Bir qator boshqa kompaniyalar ham mos belgilarni taklif qilishadi. "Bizning Nano-Boosterlarimiz juda kichik, bor-yo'g'i 1,5 kDa va juda o'ziga xos", - deydi ChromoTek marketing bo'yicha mutaxassisi Kristof Ekkert. Ushbu oqsillar yashil va qizil floresan oqsillarni (GFP va RFP) bog'laydi. Ular VHH yoki nanobodlar deb nomlanuvchi alpaka antikor fragmentlaridan olingan bo'lib, mukammal bog'lash xususiyatlariga ega va partiyadan partiyaga o'zgarishsiz barqaror sifatga ega. Ushbu markerlar SIM, PALM, STORM va STED kabi o'ta aniqlikdagi turli xil texnikalar uchun javob beradi. Merilend universiteti tibbiyot fakulteti dotsenti Ai-Hui Tang va uning hamkasblari ChromoTekning GFP-Booster va STORM-dan asab tizimida axborot tarqalishini o'rganish uchun foydalanganlar. Ular presinaptik va postsinaptik neyronlarda nanokolumnlar deb ataladigan molekulyar nanoklasterlarni topdilar. Olimlarning fikriga ko'ra, bu struktura markaziy asab tizimi sinaptik samaradorlikni saqlash va tartibga solish uchun oddiy printsiplarni qo'llaydi. Yuqori aniqlikdagi tasvirlashning turli xil versiyalari va tobora ko'payib borayotgan usullar olimlarni biologik sirlarga yanada chuqurroq jalb qilmoqda. Ko'rinadigan yorug'likning diffraktsiya chegarasini buzish orqali biologlar hatto hujayralar harakatlarini "yaqindan kuzatib borishlari" mumkin.
